การย้อมแกรมแบคทีเรียต้องหยดอะไร

กว่าจะรู้ว่าเป็นแกรมบวกหรือแกรมลบ: เบื้องหลังหยดสีเล็กๆ ในการย้อมแกรม

การย้อมแกรม เป็นเทคนิคพื้นฐานที่สำคัญอย่างยิ่งในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา มันช่วยให้เราแยกแยะแบคทีเรียออกเป็นสองกลุ่มใหญ่ คือ แกรมบวก (Gram-positive) และแกรมลบ (Gram-negative) ความแตกต่างนี้ ไม่ได้อยู่ที่รูปร่างหรือขนาดของแบคทีเรีย แต่เป็นความแตกต่างที่ซ่อนอยู่ภายในโครงสร้างผนังเซลล์ของมัน ซึ่งเราจะสามารถมองเห็นได้ชัดเจนผ่านการใช้สารละลายสีต่างๆ ที่มีกระบวนการที่ละเอียดอ่อนกว่าที่คิด

บทความนี้จะเจาะลึกถึงขั้นตอนการย้อมแกรม โดยเน้นไปที่ “หยด” สีต่างๆ ที่ใช้และความสำคัญของแต่ละขั้นตอน เพื่อให้เข้าใจถึงกลไกที่ทำให้เราแยกแยะแบคทีเรียได้อย่างแม่นยำ

การย้อมแกรมไม่ได้เริ่มต้นด้วยการหยดสารละลายสีเพียงอย่างเดียว ก่อนอื่น เราต้องเตรียม “smear” หรือฟิล์มบางๆ ของแบคทีเรียบนสไลด์กระจก หลังจากนั้นจึงเริ่มกระบวนการย้อมดังนี้:

1. ไครสตัลไวโอเลต (Crystal violet): หยดแรกแห่งการเริ่มต้น

ขั้นตอนแรกคือการหยดสารละลายไครสตัลไวโอเลต ซึ่งเป็นสีหลัก (primary stain) ลงบน smear สีนี้เป็นสีม่วง และจะย้อมทั้งแบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบให้เป็นสีม่วง โดยการแทรกซึมเข้าไปในผนังเซลล์ และสร้างพันธะกับส่วนประกอบภายในเซลล์

2. น้ำกลั่น: ล้างสิ่งที่ไม่จำเป็น

หลังจากทิ้งไว้นานพอสมควร (ตามระยะเวลาที่กำหนดในคู่มือการทดลอง) เราจะล้าง smear ด้วยน้ำกลั่นเบาๆ เพื่อล้างไครสตัลไวโอเลตส่วนเกินที่ไม่ได้ยึดติดกับเซลล์ การล้างที่เบามือเป็นสิ่งสำคัญเพื่อไม่ให้ smear หลุดออกจากสไลด์

3. ลูโกล (Gram’s iodine): ตัวช่วยเสริมความแข็งแรง

ขั้นตอนนี้เป็นกุญแจสำคัญ เราจะหยดสารละลายลูโกลหรือไอโอดีนลงบน smear ลูโกลทำหน้าที่เป็น mordant หรือตัวเชื่อมต่อ มันจะสร้างสารประกอบเชิงซ้อนกับไครสตัลไวโอเลต ทำให้สีม่วงยึดติดกับผนังเซลล์ได้แน่นขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่งในแบคทีเรียแกรมบวกที่มีชั้นเปปทิโดไกลแคนหนา

4. แอลกอฮอล์ (Decolorizer): จุดเปลี่ยนสำคัญ

นี่คือขั้นตอนที่สำคัญที่สุดในการแยกแยะแบคทีเรีย เราจะใช้แอลกอฮอล์ เช่น แอลกอฮอล์ 95% หยดลงบน smear แอลกอฮอล์จะทำหน้าที่ละลายไขมันในผนังเซลล์ชั้นนอกของแบคทีเรียแกรมลบ ทำให้ไครสตัลไวโอเลตที่ยึดติดอยู่หลุดออกไป แต่ในแบคทีเรียแกรมบวก ด้วยชั้นเปปทิโดไกลแคนหนาที่ไม่ถูกทำลายโดยแอลกอฮอล์ ไครสตัลไวโอเลตจะยังคงอยู่ ทำให้เซลล์ยังคงสีม่วง

5. ซาฟรานิน (Safranin): สีตัดกับความแตกต่าง

ขั้นตอนสุดท้าย เราจะหยดสารละลายซาฟรานิน ซึ่งเป็นสีทับ (counterstain) ลงบน smear ซาฟรานินเป็นสีแดง และจะย้อมแบคทีเรียที่ถูกแอลกอฮอล์ล้างไครสตัลไวโอเลตออกไปให้เป็นสีแดง ซึ่งก็คือแบคทีเรียแกรมลบ ส่วนแบคทีเรียแกรมบวกที่ยังคงมีไครสตัลไวโอเลตอยู่ สีม่วงจะเข้มกว่าและจะไม่เปลี่ยนเป็นสีแดง

หลังจากล้างด้วยน้ำกลั่นอีกครั้ง และเช็ดให้แห้ง เราก็จะสามารถสังเกตแบคทีเรียแกรมบวก (สีม่วง) และแกรมลบ (สีแดง) ได้อย่างชัดเจนภายใต้กล้องจุลทรรศน์

สรุปแล้ว การย้อมแกรมไม่ได้ขึ้นอยู่กับการหยดสารละลายสีเพียงอย่างเดียว แต่เป็นกระบวนการที่อาศัยปฏิกิริยาของสารละลายแต่ละชนิดต่อโครงสร้างผนังเซลล์ของแบคทีเรีย ทำให้การหยดแต่ละหยดมีความสำคัญต่อผลลัพธ์ที่แม่นยำและเป็นประโยชน์ในการวินิจฉัยโรคต่างๆ และการศึกษาจุลินทรีย์ ดังนั้น ความเข้าใจในรายละเอียดของแต่ละขั้นตอนจึงเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับผู้ปฏิบัติงานในห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา